所謂Real-Time PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進行定量分析。real-time PCR技術(shù)即實時熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物監(jiān)測定量產(chǎn)生的偏差，提高實驗的重復(fù)性。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于監(jiān)測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果。

實時熒光定量PCR 技術(shù)的主要應(yīng)用

1. DNA 或RNA 的絕對定量分析：包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等；

2. 基因表達差異分析：例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 )，特定基因在不同時相的表達差異以及CDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證；

3. 基因分型：例如SNP 檢測，甲基化檢測等。

Realtime PCR 常用的兩種方法分別為Sybr green（熒光染料摻入法）和Taqman probe （探針法）。

SYBR green
在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

此方法適用于：

1、靈敏度高：使用SYBR可使熒光效果增強到1000倍以上

2、通用性好,不需要設(shè)計探針,方法簡便,省時,價格低廉。

3、通用型方法，在國內(nèi)外科研中普遍使用。

4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測

5、專一性要求不高的定量PCR檢測。

Taqman Probe
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步

此方法適用于：

1、具有高適應(yīng)性和可靠性，實驗結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好，特異性更高。

2、適用于擴增序列專一的體系的檢測。

3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。

4、靶基因的特異序列較短，無論怎樣優(yōu)化引物設(shè)計條件都不能解決。

5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴增，對特異性要求較高的定量。

6、廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量,在動物病原體基因的檢測,畜禽產(chǎn)品的檢驗檢疫,生物制品的鑒定。